O seu mecanismo farmacológico consiste na inibição da enzima InhA, que é necessária na síntese de ácidos micólicos que fazem parte da constituição da parede celular bacteriana. Uma vez que é um pró-fármaco, a isoniazida necessita de sofrer ativação metabólica pela KatG, uma catalase-redutase da micobactéria que permite a formação de um intermediário altamente reativo. Este entra no local de ligação da enzima InhA e liga-se por ligações covalentes à forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), causando a inibição irreversível da enzima. [6]​